“Jo Sahabat Sejati” menceritakan tentang persahabatan antara manusia dengan seekor kuda.
Seekor kuda tersebut bernama Jo yang dipelihara oleh Arif yang diperankan oleh Ismu Tanjung yang berprofesi sebagai seorang guru di salah satu sekolah.
Arif bersama adiknya bernama Lisa yang diperankan oleh Amanda Latief begitu menyayangi Jo dan rasa sayang itu juga ada dalam hati para siswa-siswi Arif.
Ada Genta yang diperankan oleh Cornel Nadeak, Cinta diperankan Novika Siregar dan Adry Wicaksono sebagai Danar juga sangat menyayangi Jo.
Awal mula terjalin persahabatan di antara Genta, Cinta, dan Danar saat Jo berhasil menyelamatkan mereka dari suatu kejadian yang berbahaya di hutan.
Semenjak kejadian itu persahabatan antara Jo dengan tiga sekawan tersebut kian erat. Masyarakat di perkampungan juga menyayangi Jo lantaran dia suka menolong warga setempat saat kesulitan.
Namun suatu ketika, datang peristiwa yang bertubi-tubi membuat Jo berada di posisi yang serba salah dan akibatnya Jo menjadi dibenci masyarakat setempat karena dituduh menjadi penyebab rentetan peristiwa yang terjadi di area perkampungan.
Tidak sampai di situ, Jo juga diusir oleh masyarakat dan terpaksa berpisah dengan para sahabatnya.
Mereka merasakan kesedihan yang cukup mendalam untuk menghadapi perpisahan tersebut dan saling merindukan satu sama lain.
Kuda pintar tersebut berharap bisa kembali lagi untuk bertemu dengan para sahabatnya, meski dia harus menghadapi berbagai rintangan terbesar dalam hidupnya.